(отрывки из доступной в Интернете книги)
 
 
 
Фото 244 - 246. Воздействие различных концентраций ауксинов и цитокининов in vitro на клетки каллюса и дифференциация каллюсных клеток при изменении соотношения этих гормонов в питательной среде (по R.Starling):
 
Astrophytum asterias — рост каллюса и его дифференциация в течение двух месяцев (244);
Leuchtenbergia principis — рост каллюса и его дифференциация в течение двух месяцев (245);
Leuchtenbergia principis — рост каллюса и его дифференциация в течение шести месяцев(246)
 
 
Рис. 68. Повторение опыта Н.И.Якушки-ной по совместному влиянию ауксинов и кинетинов на культу­ру клеток вторичной меристемы (камбия) взятых от полугодова­лых сеянцев Lophophora williamsii.
1 — рост каллюсной массы без замет­ной дифференциации клеток;
2 — активная дифференциация кал­люсных клеток с образованием придаточных корней и началом утолщения корней у основания;
3 — активная дифференциация кал­люсных клеток, в основном, с образованием стеблевой части кактуса со многими апексами и лишь незначительными корнями;
4 — очень медленный рост каллюса.
 
Центром синтеза цитокининов является кончик корня, оттуда эти гормоны разносятся по всему растению. Действие цитокининов обратно действию ауксинов: они снимают эффект апикального доминирования, активизируют рост вторичной меристемы — камбия. Меристема в зоне боковых ареол находится под постоянным воздействием этих двух групп гормонов. Интересно, что на боковую ареолу влияют ауксины, синтезируемые только в апексе стебля и цитокинины, образованные в апексах корней. Чем дальше ареола расположена от верхушки стебля, тем меньшее влияние на нее оказывают ауксины и большее — цитокинины. Как результат — подавляющее большинство деткующихся видов (за исключением кактусов с древовидной и кустовидной формой стебля) начинают образовывать боковые побеги в нижней части стебля. Если же ветвление происходит в верхней части стебля кактуса, то можно с уверенностью сказать, что ауксин-синтезирующая активность апикальной меристемы стебля снижена. Вызвать подобное явление можно и искусственным путем, а не только удалив апекс кактуса. Так апикальное доминирование может быть снято путем обработки точки роста стебля довольно высокими дозами кинетика (1 — 3 мг/л) при инъекции или нанесении ланолиновой пасты.
 
Цитокинины также задерживают старение растения, являясь, тем самым, антагонистами этилена, ускоряют процессы синтеза белка, стимулируют, как и гиббереллины, прорастание семян и повышают моторику корневой системы.
 
Однако говорить о полном противопоставлении цитокининов и ауксинов было бы неправильно. В ходе работ отечественных физиологов А.Л.Курсанова, В.И.Кефели, Н.И.Якушки-ной по культивированию меристемы на искусственных средах было установлено, что наибольшего проявления видимого роста тканей, органов, да и всего растения можно добиться лишь при комплексном применении этих гормонов.
 
Оптимальное соотношение цитокининов и ауксинов для размножения кактусов путем микроклонирования — 0,5 мг/л к 1,8 мг/л соответственно с отклонениями ± 3,1 — 7,3%. При таком сочетании прежде всего стимулируется развитие корневой системы, а затем и всего растения.
 
 
 
Микроразмножение
 
 
 
Микроразмножение кактусов — сравнительно новый способ их вегетативного размножения, хотя в растениеводческой практике размножение растительных клеток in vitro (в стекле) довольно широко применяется. Для обозначения этого метода в зарубежной и отчасти в отечественной литературе используется термин «микропропагация» (micropropagation), что полностью соответствует «микроразмножению», а иногда и термин «клонирование».
 
Для любопытного читателя нелишним будет небольшой исторический экскурс.
 
В конце девятнадцатого века немецкие ботаники Фехтинг и Рехингер проводили опыты по выращиванию небольших кусочков растительных тканей. Однако уровень знаний физиологии растительной клетки в те времена был довольно низок, и их опыты окончились неудачей. То же можно сказать и об экспериментах Габерландта в 1902 году.
 
Далее в истории микроразмножения наступает почти тридцатилетний перерыв, связанный с поиском объектов, искусственных сред и условий для роста изолированных тканей и клеток.
 
В 1932 — 1934 годах французскому физиологу Роже Готре и американскому — Филиппу Уайту удалось добиться эффективного роста и развития клеток, взятых из корневой меристемы, камбия древесных растений, а затем клеток из запасающей паренхимы моркови и петрушки. Именно оттуда тянется узенькая тропиночка к современному клонированию суккулентных растений.
 
Разработка и совершенствование искусственных питательных сред, использование в качестве доноров для изолированных клеток и тканей все большего количества видов, разработка условий консервирования и длительного хранения изолированных тканевых и клеточных культур — основные вехи экспериментаторской работы ученых в 40 — 50-х годах. Сегодня насчитывается более 400 видов растений, с которыми были проведены подобные опыты.
 
В настоящее время разработаны методики по выращиванию in vitro культуры тканей на агаровой среде в виде каллюсной массы или в жидкой среде в виде взвеси из одиночных клеток или кусочков ткани.
 
Культура изолированных органов, тканей и клеток для клонального размножения растений, оздоровления растительного материала от вирусной инфекции, регенерация растений из каллюсных культур имеют широкое практическое применение. В декоративном растениеводстве огромная масса работ проведена по микроразмножению орхидей, сенполий, глоксиний, немало удачных экспериментов проведено над суккулентными растениями и над кактусами, в частности.
 
Цель этой главы — не только познакомить читателя с методиками клонирования, но и дать рекомендации по культуре изолированных тканей кактусов на агаровой среде применительно к осуществлению этого метода в домашних условиях. При изложении материала автор будет опираться как на результаты своих опытов, так и на работы Р.Г.Бутенко, Н.В.Катаевой, З.Б.Шаминой, В.В.Уманцевой, J.L.Johnson, E.R.Emio, R.Starling, J.R.Ault, W.J.Blackmon, P.W.Clayton, J.F. Hubstenberger, G.C.Phillips и других. С позволения редакции журнала Bradleya автор приводит фотографии из работы W.Stuppy & W.Nagl «Regeneration and propagation of'Ariocarpus retusus Sclieidw. (Cactaceae) via somatic embryogenesis», а также фотографии, предоставленные голландским физиологом R.Wellens специально для иллюстрации этой главы.
 
В главе, посвященной прививке кактусов, говорилось, что при срастании частей прививки основную роль играет камбий — вторичная меристема. Клетки запасающей и сердцевинной тканей не срастаются, а скорее, склеиваются. В большинстве случаев это так. Однако нельзя не отметить, что открытые участки запасающей ткани, неизбежно образующиеся при прививке, как правило, не высыхают*. На травмированной поверхности вырастает тонкий слой мелких клеток, способных к активному делению, т.е. меристематических, закрывающих собой раневую поверхность и способствующих регенерации поврежденных тканей. Таким образом, хотя и с разной степенью
 
* если подвой или привой во время свития находится в состоянии стагнации  - - не исключено высыхание, пирон па чо.гынгю г.п'онну, паренхимных тканей и даже полное высыхание одной из частей прививки или всего комплекса.
 
 
 
интенсивности, каллюсная меристема образуется из любой ткани. Исключением являются разве что ткани колючек, опушения и механические ткани в чистом виде — т.е. те ткани, клетки которых в достаточной степени лигнифицированы и не способны к делению.
 
Каллюсные культуры получают из разных органов и тканей: стеблей, корней, цветоносов, частей цветка, зародышей и его частей, у имеющих листья растений — из листьев .
 
Применительно к клонированию кактусов in vitro в домашних условиях мы будем говорить лишь о методах культуры тканей для клонального размножения растений.
 
Результативность этих методов необычайна. Так при посеве кактусов семенами даже при 100%-й всхожести можно ожидать не более 2% «двоен». При вегетативном размножении от маточного растения теоретически можно получить число боковых побегов, соответствующее количеству ареол — практически же — гораздо меньше. При микроразмножении от одного кусочка каллюсной меристемы, содержащей даже 10 — 100 клеток, можно получить неограниченное количество растений. Например от одного зародыша (Parodia elegans) автору удалось получить 38 растений. Естественно, что генный набор у подобных растений идентичен, и генеративное размножение их путем перекрестного опыления между одноклоновыми экземплярами представляется сомнительным, но имеется неоспоримая возможность сохранения неординарных фенотипических признаков какой-либо высокодекоративной формы.
 
Суть методов микроразмножения следующая: от растения берут часть ткани и после соответствующей антисептической обработки помещают на стерильную искусственную среду. В результате активного роста раневой меристемы образуется каллюсная масса клеток, из которой, в свою очередь, формируются побеги.
 
Как уже было сказано выше, практически любая ткань может формировать каллюсную меристему на искусственной питательной среде. Однако применительно к микропропагации кактусов в подавляющем большинстве случаев берут либо меристематические ткани, либо целые зародыши. По типу донорской ткани, используемой для клонирования кактусов, методы можно условно разделить на две группы:
 
1. способ микроразмножения «меристематической тканью»;
2. способ микроразмножения «меристематическими эмбрионами».
 
Неоднократно проводились опыты по использованию тканей семени (эндосперма), однако в микроразмножении кактусов, особенно в домашних условиях, они не применяются. Как правило, не используют с этой целью ткани завязи и других частей цветка.
Перед более конкретным рассмотрением способов клонирования кактусов необходимо ознакомиться с оборудованием, инструментами, методиками приготовления и использования искусственных питательных сред.
Главным залогом успеха в подобных опытах является чистота всего оборудования. Поэтому в помещении, где будут проводиться подобные работы, необходимо произвести влажную уборку.
 
 
Оборудование
 
В качестве основного растворителя для приготовления питательных сред можно использовать прокипяченную дважды с интервалом в сутки воду, но лучше применять дистиллированную воду, которую можно приобрести в аптеке или приготовить самостоятельно с помощью дистилляторов несложной конструкции.
 
Кактусоводу также потребуется кварцевая или увиолевая лампа. При работе с аппаратурой,


Рис. 90. Простейший дистиллятор на основе двух стеклянных банок (по А.М.Шитову).
1. паровичок
2. водяная баня
3. электронагреватель
4. пароотводная трубка
5. термометр
6. водопроводная вода
7. трубопровод
8. холодильник
9. пароприемная трубка
10. перепускная трубка
11. подставка-тренога
12. охладитель — холодная вода
13. раковина

Рис. 91. Дистиллятор на   основе скороварки и водяного холодильника (по А.М.Шитову).
1. паровичок-скороварка
2. трубопровод
3. термометр
4. каплеуловитель (можно не применять)
5. водопроводная вода
6. холодильник
7. приток холодной воды
8. отток воды из холодильника
9. газовая горелка
10. плита
11. выпускная трубка
12. приемный стакан
13. штатив
 
испускающей жесткие ультрафиолетовые лучи, следует соблюдать соответствующую технику безопасности — не находиться длительное время в комнате, где работают лампы. При необходимости пользоваться защитными очками.
Для места проведения работ кактусоводу потребуется соорудить специальный бокс.
 
Бокс изготавливают наподобие аквариума из алюминиевого уголка и оргстекла, т.к. обыкновенное стекло не пропускает ультрафиолетовые лучи. Наиболее оптимальные размеры бокса: длина 80 см, ширина 50 см, высота 50 см. Боковую стенку делают откидной и окантовывают резиновым или пенополиуретановым уплотнителем. В передней стенке делают два отверстия диаметром около 12 см — под руки. К краям отверстия приклеивают раструбом перчатки из прочной резины. Длина перчаток должна обеспечивать свободный доступ руки в любой угол бокса, поэтому в некоторых случаях раструб придется нарастить, приклеив резиновым клеем раструб от других перчаток. Все швы в боксе герметизируют.
 
Перед применением бокс тщательно моют и высушивают. Его устанавливают на прочную нешатающуюся опору и облучают кварцевыми лампами с короткого расстояния не менее 30 минут.
 
Рис. 92. Самодельный бокс для работ с билогическим материалом. Изготавливается из оргстекла и алюминиевых уголков. Бо­ковая стенка делается откидной и оснащается уплотнителем. Резиновые перчатки из тол­стой резины вклеиваются раст­рубами в специально проделан­ные отверстия.
 
Нелишним будет и расположение лампы внутри бокса и облучение его внутренней поверхности.
При более объемных работах по микроразмножению размеры бокса можно увеличить В оптимальном варианте увиолевую лампу можно установить прямо в боксе, выведя провода пускорегулирующей аппаратуры за пределы бокса. В длинном боксе целесообразно предусмотреть еще пару отверстий с перчатками.
Непосредственно за 1 час до работы лампы включают на 30 минут.
 
 
 
Инструмент, посуда и материалы
 
В качестве посуды используют стеклянные или одноразовые пластиковые пробирки, чашки Петри или банки. Стеклянную посуду предварительно моют, ополаскивают 10 — 15 раз водопроводной или 3 — 4 раза дважды прокипяченой водой, высушивают, оборачивают чистой писчей бумагой и помещают в сушильный шкаф, а в домашних условиях — в духовой шкаф Стеклянную посуду прогревают при температуре + 120 — +140 °С не менее двух часов После прогрева посуду хранят, не разворачивая бумагу.
 
Одноразовая посуда не требует предварительной обработки в случае целостности упаковки Некоторые пластики выдерживают нагрев более +100 °С, поэтому подобную посуду можно кипятить. В противном случае, одноразовую посуду, находящуюся в поврежденной упаковке, в домашних условиях использовать нельзя.
 
 
Рис. 93. Посуда, применяемая для микро­размножения:
1. банка с крышкой
2. чашка Петри
3. пробирки в штативе
В качестве инструмента лучше всего применять остро заточенные медицинские скальпели. Режущий инструмент заворачивают в марлю, помещают в емкость с водой и кипятят не менее 30 минут либо прогревают, завернув в бумагу, в духовом шкафу аналогично стеклянной посуде.
 
В настоящее время для микроразмножения наиболее часто применяются следующие питательные смеси (таблица составлена В.Урманцевой):
 
 
Наиболее же часто употребляется среда Мурасиге-Скуга (Murashige-Skoog).
 
На первый взгляд рецепты довольно сложные, и не представляется возможности приобрести некоторые ингредиенты. Поэтому стоит подробнее остановиться на компонентах наиболее популярной питательной среды Мурасиге-Скуга:
 
NH4NO3 — аммиачная селитра — довольно широко применяемое минеральное удобрение;
 
KNO3 — калийная селитра, тоже применяется в качестве минерального удобрения;
 
КН2РО4 — суперфосфат [точнее, это дигидрофосфат калия, а основа суперфосфата - Ca(Н2РО4)2 ];
 
СаСl2 • 2Н2О — хлористый кальций можно приобрести в виде 10%-го раствора в аптеке;
 
MgSO4 • 7Н2О применяют в качестве минерального удобрений, продается в аптеке;
 
соли железа применяются при обработке фотоматериалов и т.д (пример: железный купорос);
соли микроэлементов выпускаются в комплексах как микроудобрения, их рецептурный состав может незначительно варьировать, но заметного отрицательного влияния это не имеет;
 
в качестве органических добавок можно использовать вытяжки из культуры дрожжей, эндосперма конского каштана, плодов фасоли. Вообще, любой активно растущий сочный побег (особенно проростки злаковых и бобовых растений) может служить субстратом для питательной среды;
 
из фитогормонов в свободной продаже можно увидеть гетероауксин и целый калейдоскоп биостимуляторов неизвестного состава, поэтому в качестве фитогормональной составляющей можно использовать воду (молоко) кокосового ореха, вытяжку из эндосперма кокоса или других незрелых плодов;
 
в качестве сахарозы можно применять обыкновенный свекольный или тростниковый сахар, лучше рафинированый;
 
агар-агар — желатиноподобное вещество. Агар-агар из водорослей растворяют при подогревании. Агар-агар из сои требует более длительного набухания в холодной воде с последующим подогреванием на водяной бане. Вместо агара можно использовать пищевой желатин или густой крахмальный клейстер.
 
Составление питательных сред начинают с приготовления растворов солей. Как правило, соли макроэлементов растворяют в небольшом объеме воды, чаще всего в 10 раз меньшим, чем рабочий раствор. В таком виде растворы солей удобнее и хранить, и добавлять в питательные смеси.
 
В случае использования удобрений требуется произвести расчет содержания необходимого вещества в удобрении и, в соответствии с этим показателем, сделать корректировку веса компонента. Макросоли и удобрения взвешивают, и навески растворяют по отдельности. Хранить такие растворы можно в холодильнике до 1 месяца. При применении растворов макросолей на 1л общего объема питательной среды берут по 100 мл их растворов.
 
Соли микроэлементов растворяют в 1/1000 от рабочего объема раствора питательной среды и при добавлении их в раствор берут 1 мл на 1 л среды.
 
Очень ответственно следует отнестись к приготовлению растворов солей железа. Само железо должно перейти в хелатную форму, поэтому навески солей растворяют по отдельности, смешивают и доводят до объема с конечной концентрацией 5 мл/л. Раствор должен получиться ярко-желтого цвета, рН 8,0. Хранить такой раствор следует в холодильнике 3 — 4 месяца. Неправильное приготовление хелатного железа может привести к выпадению в осадок фосфатов кальция и магния.
 
Концентрированные растворы витаминов готовят из расчета 1/1000 от конечного объема и добавляют 1 мл на 1 л раствора среды. Растворы витаминов хранят в замороженном виде.
 
В опытах автора очень неплохо зарекомендовала себя смесь витаминов под коммерческим названием «Ундевит». Одно драже используется для приготовления 10 л питательного раствора, поэтому драже растворяют в 100 мл воды и добавляют 10 мл на 1 л конечного раствора. В комплексе « Ундевит» содержится достаточное количество биологических антиоксидантов — витаминов С и Е, что стимулирует начальную фазу образования каллюсных клеток.
 
Реальную трудность в приобретении представляют фитогормональные компоненты и мезоинозит. Как уже говорилось выше, мезоинозит, как один из элементов веществ группы биоса может быть получен из дрожжевой культуры. В данном случае после ферментации требуется полностью убить грибные клетки. Это осуществляется кипячением емкости (банки) с культурой дрожжей в водяной бане под давлением. В домашних условиях этот процесс проводят в скороварке. Культура дрожжей подвергается кипячению (автоклавированию) 15 — 30 минут, фильтруется и замораживается.
 
При необходимости фитогормоны получают из растительного материала. Следует помнить, что некоторые биологически-активные вещества термолабильны, т.е. разрушаются при нагревании, поэтому после измельчения растительного субстрата, экстрагирования и фильтрации через
 
Рис. 94. Расположение агара в пробирках:
1a. «прямой агар»
1b. «косой агар»
2. способ расположения пробирки с расплавленным агаром для
приготовления «косого агара». Пробирки закрыты ватными тампо­нами.
 
хлопчатобумажную ткань экстракт стерилизуют путем продолжительного (0,5 —1,0 ч) облучения ультрафиолетом.
 
Подобным образом стерилизуют воду кокосового ореха и экстракт из незрелых плодов конского каштана. При экстрагировании биологически-активных веществ из эндосперма кокоса следует учитывать, что кокосовое масло твердое, поэтому эндосперм измельчают на терке и растирают в ступке с небольшим количеством сахара и воды. Полученную массу перекладывают на хлопчатобумажную ткань и выжимают. К жидкости добавляют равное количество этилового спирта, тщательно перемешивают и отфильтровывают. Фильтрат помещают в холодильник и после застывания на его поверхности масла аккуратно проделывают два диаметрально противоположных отверстия и сливают жидкость в отдельную стеклянную емкость. Для удаления спирта жидкость нагревают в водяной бане. Далее жидкость переливают в емкость из оргстекла или пластиковый пакет и облучают ультрафиолетом.
 
Так же неплохо себя зарекомендовал в качестве биологически-активной добавки настой биогумуса. Его готовят из расчета 100 г сухого биогумуса на 1 л воды при температуре +55 •— +60 °С, настаивают в течение суток, дважды фильтруют через ткань и через фильтровальную бумагу и облучают ультрафиолетом.
 
Перед употреблением ингредиенты смешивают, при необходимости корректируют рН до 5,5 — 6,5 , добавляя по каплям НС1 или NaOH .7 — 8 г агара растворяют в 200 мл воды, нагревают в водяной бане и добавляют в смесь при постоянном перемешивании. Объем раствора доводят до 1 л. Естественно, показатель рН несколько повысится, и его повторно корректируют.
 
Среду разливают в чашки Петри, банки и пробирки. Чашки Петри и банки закрывают крышками. Пробирки закрывают ватными пробками, пробки сверху обертывают целлофаном или пергаментом и затягивают резинкой. Для получения косого агара пробирки располагают наклонно до застывания агара.
 
В некоторый случаях, когда часть питательной среды остается невостребованной, ее переливают в отдельную емкость, нагревают на водяной бане, не доводя до кипячения, закрывают емкость крышкой или пробкой, охлаждают и хранят в холодильнике при температуре около +4 °С не более одного месяца. При необходимости емкость нагревают в водяной бане и расплавленную питательную среду разливают по сосудам.
 
 
 
Стерилизация исходного материала
 
Как уже говорилось, культуру каллюсных клеток можно получить практически из любого вегетативного и генеративного органа, но при микроразмножении кактусов используют меристематические ткани, либо первичные, либо вторичные.
 
В качестве материала для клонирования «меристематической тканью» используют клетки камбия (вторичной меристемы), апекса стебля или меристематические клетки ареол. В случае расположения вегетативной точки в аксилле (например, Mammillaria sp.sp), в субаксиллярном пространстве (например, Dolichothele sp.sp.) или в продольной борозде, соединяющей аксиллу и ареолу (например, Coryphantha sp.sp.), используют ткани из этих зон, т.е. для микроразмножения применяется меристема вегетативных точек.
 
Наиболее трудной задачей на этом этапе является получение стерильного материала — применительно к микропропагации такой материал называется эксплантат.
 
Для поверхностной стерилизации растительных объектов применяются хлорсодержащие вещества (гипохлорит натрия — 1 — 1,4%; гипохлорит кальция — 7 — 10%; хлорамин —2 — 10%); ртутьсодержащие вещества (сулема 0,1%; диацид); перекись водорода (2 — 10%); этиловый спирт (70 — 75%). Кактусоводу придется подбирать вид и концентрацию этих веществ опытным путем,т.к. разные экземпляры кактусов даже одного ботанического наименования и, естественно, их ткани неодинаково реагируют на воздействие различных стерилизующих веществ. Ориентироваться можно на следующие показатели:
 
 
 
Кактус, предназначенный к операции, моют с применением перманганата калия, высушивают, удаляют с поля операции опушение ареолы и обрезают колючки, стараясь при этом не выламывать их, т.к. это может травмировать меристематическую ткань ареолы, что, в свою очередь, ставит под сомнение успех микроразмножения из ареолярной меристемы.
 
Сегмент стебля вырезают и помещают в стерилизующий раствор. Через заранее определенное время эксплантат вынимают и помещают в стакан с дистиллированной или дважды прокипяченной водой, выдерживают 10 минут, меняют воду еще два раза и выдерживают в каждой порции 15 — 20 минут.
 
Мелкий материал: семена, ареолы — помещают в марлевый мешочек, который завязывают ниткой и стерилизуют аналогичным способом. Семена предварительно обрабатывают спиртом, затем — дезинфицирующим веществом и оставляют до набухания в стерильной чашке Петри. После суточного интервала семена стерилизуют повторно.
 
 
Начальная стадия микроразмножения
 
Через откидную дверцу в бокс ставят спиртовку или свечи, сосуды с искусственной питательной средой, кладут спички, режущий инструмент, завернутый в бумагу, стерильные чашки Петри и фильтровальную бумагу, емкость для отработанного материала. Дверцу закрывают и бокс облучают ультрафиолетом в течении получаса. Еще через полчаса в бокс кладут подготовленный растительный материал под стеклянным колпаком, тщательно закрывают дверцу бокса и повторяют облучение ультрафиолетом в течение 10 — 15 минут. По истечении этого срока комнату проветривают и приступают к посеву.
 
Прежде всего зажигают спиртовку (можно использовать сухое горючее) или свечи. Вокруг горящего пламени спиртовки создается стерильная сфера диаметром 20 — 30 см, от пламени свечи — до 15 см, поэтому при использовании свечей их ставят вокруг операционного поля.
 
Подготовленный эксплантатный материал помещают на фильтровальную бумагу или в чашки Петри и обрезают лишние ткани, особенно это относится к сегментам стебля. Сеянцы с предварительно удаленными корнями и колючками разрезают вдоль.
 
При наличии практики с семян удаляют кожуру, но можно применять и нешелушеные семена либо, что лучше — стерилизованные суточные проростки.
 
Эксплантаты переносят на питательную среду и слегка вдавливают в агар. Посуду со средой и крышки проносят над пламенем, не обжигая при этом эксплантаты, закрывают и оставляют в боксе в темноте при температуре около +26 °С и влажности воздуха около 10%*.
 
 
Получение каллюсной культуры
 
Примерно на 8 — 10-й день после посева происходит разрастание каллюсной массы, позволяющее выделить наиболее активно растущие участки. Через 3 — 4 недели такие части каллюсной меристемы отделяют и сеют в другую посуду. Эти манипуляции называют субкультивированием.
 
*влажностные параметры в замкнутых сосудах при такой температуре соответствуют данным требованиям.
 
 


Фото 451. Побеги Ferocactus acanthoides из аксилярного каллюса после 65-тидневного культивирования на модернизированной среде Мурасиге-Скуга с содержанием 5,4 мг/л ИУК и 46,5 мг/л кинетика.
(по J.Ault и J.Blackmon)

Фото 452. Побеги Leuchtenbergia principis из апикального каллюса после 6-ти месяцев культивирования на модернизированной среде Мурасиге-Скуга с содержанием 10 мг/л ИУК и 100 мг/л БАП.
(по R.Starling)
 
 
Следует помнить, что работать целесообразнее с выделенной и отобранной культурой, т.к. эта часть каллюсной меристемы наиболее приспособлена к росту на данной конкретной среде. При строго научном подходе выделение активно растущих участков ткани проводят еще 8 — 10 раз, но в прикладном аспекте эти мероприятия излишни, и уже с первично выделенным каллюсом можно работать.
 
На первоначальных этапах при росте каллюсной меристемы следует учитывать фактор соотношения ауксиновых и цитокининовых гормонов в питательной среде. Напомню, что это соотношение следует выдерживать 10:1 (2,0 — 3,0 мг/л ауксина, 0,2 — 0,3 мг/л кинетина). При нарастании достаточного количества каллюсной массы (примерно через 6 — 8 недель) ее делят на несколько кусочков, которые переносят в отдельную посуду на свежую среду с большим содержанием цитокининовых гормонов.
 
 


Фото 453. Клоны из аксиллярного каллюса Pediocactus knowltonii на среде Мурасиге-Скуга с содержа­нием 114 мг/л ИУК и 228 мг/л зеатина.
 
(по Ph.Clayton, J.Hubstenberg, G.Phillips)

Фото 454. Корнеобразование у клона Ferocactus acanthoides через 95 дней после субкультивирования на без­гормональной среде Мурасиге-Скуга. (по J.Ault и J.Blackmon)
 
По результатам опытов Р.Старлинга, Дж. Аулта и В.Блакмона, Ф.Клайтона и др. (в том числе и автора) максимальное побегообразование на каллюсной меристеме наблюдалось при культивировании на средах с равным (10 мг/л ауксина и 10 мг/л цитокинина) или обратным первоначальному соотношением ауксинов и цитокининов 1 : 10 (в различных опытах 0 — 10 мг/л ауксина, 10 — 100 мг/л цитокинина). Это естественно, т.к. цитокинины стимулируют побегообразование, в то время как ауксины тормозят его.
После развития хорошо сформированных побегов их отделяют и высаживают на среды с повышенным содержанием ауксинового гормона, что стимулирует закладывание и рост корней.
 
Аулту и Блакмону удалось добиться 90% сохранности полученных растений (Ferocactus acanthoid.es) при переводе их в корнесобственную культуру. В качестве субстрата применялась смесь из 2 частей перлита, 1 части верхового торфа, 1 части хорошо измельченной еловой коры, взятых по объему. Автору же не удалось получить более 30% сохранности растений при переводе их на аналогичный и более легкий субстрат. При переводе молодых растений на гидропонную среду* сохранность приближалась к 80%. Гораздо удачнее оказались опыты по привитию клонированных кактусов, еще не сформировавших корневой системы, на молодые перескиопсисы. Сохранность привитых растений приближалась к 90%, а при переводе их в корнесобственную культуру через год после привития удавалось получить до 80% молодых растений от первоначального количества клонов. Отход клонированных растений можно объяснить прежде всего недостатком живительных солнечных лучей в регионе Москвы и севернее, и невозможностью предоставления молодым активно-растущим кактусам необходимых условий при культивировании их под искусственным освещением.
 
При прививке побегов из каллюсной меристемы на перескиопсисы следует соблюдать относительную чистоту материалов: почвенный субстрат перед использованием заливают крутым кипятком, так же поступают и с горшками. Перескиопсисы можно использовать «в чистом» виде, но лучше заранее привить на них «переходники» — небольшие, около 5 мм детки эхинопсисов. Естественно, подобной прививке дают время срастись и проявить видимый рост.
 
Перескиопсисы вынимают из субстрата, отмывают субстрат с корней и обрабатывают одним из стерилизующих растворов. После этого перескиопсисы высаживают в обработанный субстрат и закрывают чистым колпаком. Подвоям дают время для адаптации и только после проявления видимого роста приступают к прививке.
 
Прививают традиционно, методом «прямого среза». Прививку помещают в мягкие условия и после надежного срастания постепенно приучают к свету. Во время роста привой довольно часто образует зачатки придаточных корней, так что укоренение этих растений не представляет труда. В противном случае проводят стимуляцию корнеобразования путем перерезания части стелы привоя или инъецированием водным раствором ИУК.
 
Микроразмножение соматическими эмбрионами
 
Название метода говорит само за себя — из каллюсной меристемы формируются не побеги, а зародыши, аналогичные зародышу семени. В большинстве случаев в качестве материала используют зародыши, находящиеся еще в завязи цветка — ткани этих зародышей интенсивно делятся и представляют собой плодотворный материал для исследований на генном и цитологическом уровне. Однако применительно к кактусам в доступной литературе не удалось найти описания результатов таких экспериментов. Автор проводил подобные опыты, но они были единичны, и судить о результатах представляется некорректно, хотя эти единичные эксперименты были очень эффективны.
 
В подавляющем большинстве случаев материалом для данного способа являются созревшие семена, порой лежалые. Всхожесть у таких семян редко превышает 30%. При достаточном количестве семян с такой всхожестью можно смириться и проводить традиционный посев в почвенный субстрат. Но каково же бывает разочарование кактусовода, когда он получает десяток семян долгожданного растения от зарубежного или внутреннего поставщика, а всхожесть этих семян оставляет желать лучшего.
 
При микроразмножении меристематическими эмбрионами из одного жизнеспособного зародыша можно получить до 2 — 3-х десятков и даже более растений. Это эффективнее вегетативного размножение черенками или боковыми побегами-детками.
В простейшем варианте семена стерилизуют по описанной выше методике и размещают на искусственных средах. На каждое семя целесообразнее нанести по капле дистиллированной воды.
 
*« качестве эксплантатного материала использовалась меристема от: Mammillaria parkinsonii, M.pringleyi, M.hafmiana, Astrophytum asterias, A.capricorne, A.ornatum, Blossfeldia Hlliputana, Ariocarpus scapharostru.4, A.retusus, Roseocuclus kolschoubeyanus, Gymnocalycium comarapense, G.gibbosum, G.fleisherianum, Parodia elegans, P.lauii, P.neglectoides, P.backebergiana..
** при достаточном навыке удается выделить зародыши далее из семян таких видов, как Azlekium ritteri, Blos.sfeldia .чр..чр., мелкосеменные Parodia sp.sp., Strombocactus disciformis.
 
 


Рис. 95. Бинокулярная лупа-козырек — удобное приспособление при работе с семенами.

Фото 455. Зародыши Echinocactus horizonthalonius, освобожденные от наружного интегумента (1) и от внутреннего интегумента (2). Внутренний интегумент имеет вид тонкой коричневатой пленочки и насыщен ингибиторами роста клеток — при культивировании на питательных средах его необходимо удалять. На освобожденные зародыши наносят по капле дистиллированной воды в целях стимулирования их более успешного набухания.
 
 
Более результативной представляется методика выделенных зародышей. Суть ее следующая:
 
— удобные по размеру для манипуляции семена** обрабатывают этиловым спиртом;
— переносят на чистую фильтровальную бумагу и остро отточеным глазным скальпелем при визуальном наблюдении через лупу* удаляют переднюю часть — «крышечку» семени;
— с помощью острой препаровальной иглы постепенно обламывают семенную кожуру и обнажают зародыш;
— семена-лодочки (Astrophytum sp.sp., Frailea sp.sp.) берут за «борта» глазными пинцетами, разрывают и извлекают зародыши.
 
В специально отведенной для этого главе будет описано и строение семени, и строение зародыша. Здесь же следует отметить, что кроме плотной наружной кожуры зародыш покрыт тоненькой пленочкой**. Пленочка имеет коричневатую окраску или бесцветная, может прилегать к кожуре, но чаще облегает зародыш. В этой пленочке содержится большое количество ингибиторов ростовых процессов, в частности АБК, поэтому ее необходимо удалять.
 
Выделенные зародыши помещают на увлажненную фильтровальную бумагу в чашки Петри для набухания, либо сразу на питательную среду и наносят на них по капле дистиллированной воды. Более простой прием — высеять стерилизованные семена на влажную бумагу в чашки Петри и дождаться их прорастания. Но здесь опять-таки встает проблема всхожести семян.
 
В последнем случае набухшие зародыши стерилизуют и высевают на питательную среду при соотношении ауксинов и цитокининов 10 : 1.
 
Примерно через месяц выделяют наиболее активно растущие участки каллюсной меристемы и пересаживают их на свежую среду с соотношением ауксинов и цитокининов 1 : 1. В опытах автора зародыши из семян 93 видов кактусов (из родов Ariocarpus, Roseocactus, Neogomesia, Astrophytum, Mammillaria, Parodia, Gymnocalycium, Blossfeldia, Aztekium, Strombocactus, Discocactus) к концу третьего месяца начинали формировать эмбрионы, а еще через 1,5 — 2 месяца количество эмбрионов достигало 20 — 30.
Эмбрионы отделялись и высаживались на первоначальную среду при соотношении ауксинов и цитокининов — 10 : 1 и через 7 — 20 дней прививались на тонкие черенки перескиопсисов.
 
Ступпи и Нагл дают несколько отличную методику на примере микроразмножения A riocarpus retusus.
Они использовали более твердую среду Мурасиге-Скуга (10 г/л агара) с добавлением 200 мл/л воды кокосового ореха в качестве цитокининового компонента и 20 мг/л сахарозы, т.е. 2/3 от рецептурной дозы. Показатель рН доводили до 5,9
 
Семена стерилизовались 70% этиловым спиртом и высевались на питательную среду. Через 4 месяца отбиралась каллюсная меристема и высаживалась на свежую среду с содержанием меньшего количества кокосовой воды — 150 мл/л. Субкультивирование проводилось каждые восемь недель.
Первые соматические эмбрионы появлялись на 3 — 4-й месяц после первоначального посева.
 
* с этой целью используют либо часовую лупу, либо бинокулярную лупу-козырек.
** эти покровы семени называются наружный и внутренний интегумент.
 
 
 
 
Фото 456 - 460. Из статьи W.Stuppy & W.Nagl «Regeneration
and propagation ofAriocarpus retusus Scheidw. (Cactaceae)
via somatic embryagenesis».       (Bradleya 10/1992)
 
456. Группа соматических эмбрионов на кусочке каллюса через 14 месяцев субкультивирования.
457. Соматический эмбрион крупным планом — видны семядоли.
458. Соматические эмбрионы на безгормональной среде — видны характерные корневые волоски на нижней части эмбрионов.
459. Эмбриогенез каллюса на безгормональной среде — каллюс продолжает формировать соматические эмбрионы.
 
 
460. Соматический эмбрион Ariocarpus retusus через три месяца после прививки на Pereskiopsis velutina
 
Небольшое отставание во времени, по видимому, можно объяснить использованием в качестве материала цельных семян и слабой диффузией ингибиторов из присеменной зоны субстрата.
 
Соматические эмбрионы достигали 5 мм величины и начинали образовывать каллюс. Это естественно, т.к. довольно велика доля цитокининового ингредиента. Однако в опытах автора на том же материале при концентрации кокосовой воды 100 мл/л питательной среды эмбрионы не образовывали каллюс, а «ветвились», формируя по 2 — 4 апекса (41% от общего количества эмбрионов A.retusus). При снижении же доли цитокининов и параллельном повышении уровня ауксинов (исходная рецептура среды Мурасиге-Скуга), действительно, начиналось активное образование каллюса на эмбрионах.
 
Фото 461. Ветвление соматического эмбриона Ariocarpus retusus после трехмесячного субкультивирования на безауксиновой среде Мурасиге-Скуга с добавлением 100 мл/л кокосовой воды и при 12-тича-совом световом периоде искусственного освещения 12000лк
В опытах Ступпи и Нагла за первые 12 месяцев было получено всего несколько соматических эмбрионов. Они были оставлены и при достижении размера 5 — 7 мм начали формировать каллюс. Через 14 — 16 месяцев (напомню, после 7 — 8 циклов субкультивирования, а это уже переводит эксперимент не в практическое, а чисто научное русло) каллюс стал активно формировать мелкие, многочисленные, тесно прижатые друг к другу эмбрионы. Некоторые из них имели до пяти семядолей.
 
Эмбрионы отделяли и высаживали на среды Мурасиге-Скуга и Шинке-Хильдебрандта, приготовленные только из минеральных солей, без органических добавок, т.е. переводились на своеобразную гидропонную культуру. Здесь они становились похожими на обычные проростки и через два дня начинали формировать корневые волоски. Некоторые из вполне сформированных эмбрионов высаживались вновь на полноценную питательную среду, другие начинали зеленеть и образовывать настоящие корни. Были предприняты попытки по переводу молодых растений в почвенную культуру, однако не совсем успешные, поэтому, как и в опытах автора, кактусы прививали на Pereskiopsis velutin'a.